流体静压对色氨酸合成酶平衡构象的影响
简介
细菌色氨酸（TRP）聚合酶是一个α2β2的四聚体，他是一个β二聚体两端各连接一个α-亚基，该α亚基和β亚基通过复杂的协同变构，低活性的构想开放，高活性的构想关闭，逐步达到一个稳定的状态。影响TRP合成酶构象的因素很多，包括α亚基配体、一价阳离子、溶剂、ph和温度等。然而，静水压力对色氨酸合成酶构象的影响，此前没有相关报道。
我们现在发现静水压力对构象有很大的影响。在稳定的色氨酸合成酶的平衡体现中，测定磷酸吡哆醛丝氨酸复杂的吸收光谱变化，完美发现静水压力可以使色氨酸合成酶变成稳定的低活性构象，而不是封闭的高活性构象。
样品的制备
用大肠杆菌细胞制备鼠伤寒沙门氏菌色氨酸合成酶α2β2复合体含聚酯，与trpA和鼠伤寒沙门氏菌trpB基因。将该酶稀释至终浓度为21.6µM（αβ二聚体），在0.05米三乙醇胺盐酸盐缓冲液，pH值8，要么0.1 M NaCl或NH4Cl、0.1 m L-丝氨酸，记录相关数据。
设备
用OLIS公司的改良的14卡的紫外-可见分光光度计测量了静水压力对吸收光谱的影响。采用美国ISS公司HPcell高压样品仓，压力调控范围0-4 kbar（0-400MPa）。高压电池配备了手动压力泵。外循环水浴保持样品仓温度在25°C。含有用9毫米高的石英瓶装1毫升酶溶液。覆盖着聚四氟乙烯管和浸渍在光谱级乙醇作为加压流体。缓冲液，三乙醇胺盐酸盐，pH值8，选择胺缓冲液。压力不会显著改变，单位用pKa。pH值为1 bar，每次递增后扫描，压力增大。
图1.色氨酸合酶的丝氨酸在0.1 M NaCl溶液中的吸收光谱。压力从1增加到1500bar。在1巴的TA空白缓冲用来获得基线读数。在压力范围内的光谱测量总时间约为一小时。由奥利斯公司的国际分析程序从对光谱进行了分析。
结果
图1显示了增加静水压力从1巴到1500巴的效果。
色氨酸合酶与0.1 M NaCl的存在下，测定L-丝氨酸的复合物的吸收光谱。可以看出，423nm的吸收峰非常突出，即为相应的开放的低活性构象。压力从1增加到1500 bar。
在376和467 nm有两个等色点，表明存在两种平衡方式。图1中的350到550纳米的光谱变化。
释放压力构象的可逆性分析
在350 nm以下的吸光度的缓慢增加是不可逆的，可能是由于通过丙酮酸缓慢形成实验中可消除β型L-丝氨酸。在每一个压力下的平衡常数Kp是与施加的压力的对数成比例（图1，插图）。图1中的光谱数据通过对方程1和2的全局分析进行了拟合，其中Kp是平衡常数在压力P、K0杆的平衡常数，∆V0体积对反应的改变，A0是0 bar的吸光度，AP是压强p的吸光度，和一个常数。是无限压力下的吸光度。K0为丝氨酸醛亚胺的形成0.12±0.01在25°C，与0.11的Keq值非常吻合25°C计算热分析得到的热力学参数。Global分析也提供了∆V0的反应，126±2毫升/摩尔。计算光谱分析的组件以图1中的虚线显示。增加静水压力对色氨酸合成酶L-丝氨酸0.1米氯化铵溶液的复杂光谱的的影响是相似的；然而，在1-2kbar较高的压力下，我们需要看到一个显着的变化（未显示的数据）。K0和∆V0与NH4Cl的值，由拟合得到数据，是（2.34±0.08）×10-4和171±2毫升/摩尔：
