数字频域法原理简介
数字频域法原理简介
一、频域法理论基础
假定一个无限窄的脉冲光，激发荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态，一般的吸收激发辐射的关系：
其中
是荧光在t=0时的强度，τ为荧光强度衰减到初始强度的e-1 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。τ即为“荧光衰减时间”。
在实际多成分组成环境下的包含
个荧光分子，荧光强度描述关系：
其中系数
叫做前指数因子，衰减方程的复杂性反映了体系中荧光物种的多样性或存在状态的复杂性。这些参数与占比
有直接关系，表示第i项荧光分子所占总荧光发射的比重。
无论是单指数拟合还是复合指数拟合，瞬态荧光光谱设备都是测量
，以及其他能够表征各部分荧光分子的荧光寿命衰减时间。
我们使用
和
表示傅里叶变换方程的实数和虚数部分，即
通过简单运算，方程可以转变为
对于单指数衰减，
，因此，上面的表达式可以转变为
为了表征复平面傅里叶变换，我们定义
和
分别代表荧光调制频率的相角和调制率。我们定义
通过这种定义，我们能够将傅里叶变换的和部分表述成
对于单指数而言，
以上即为频域荧光寿命测量的基本公式依据。
二、模拟频域技术（Analog Frequency Domain (AFD) Technique）
频域调制技术可以选择脉冲光源激发，也可以选择调制光源激发。一般调制激发光源的调制频域选择，依据激发荧光物的寿命而定。通常选择的调制频率的倒数近似荧光物寿命值，荧光寿命测量更准确。
Figure 1 图示为发射光（EX）随调制的激发光束变化示意图。其中DC和AC为光信号调制的直流和交流信号强度。
荧光的相位频移量和解调取决于选择的调制频率；数据的拟合有别于典型的时间衰减模型。此调制示意图也被称为模拟频率法。（Analog Frequency Domain (AFD) Technique）
三、数字频域法信号采集（Digital Frequency Domain (DFD)）
在DFD中使用的光源为脉冲光，脉宽约2ns；调制（重复）频率范围在1MHz-80MHz。可以选择窄脉冲光源（激光器：50ps脉宽），超连续激光器：5ps脉宽；或者飞秒脉宽的多光子激光器）。
Figure 2 ISS常用激发光源选择
举个例子，当使用调制频率10MHz是，激发脉冲包含一系列的调谐频率20,30,40，……10n MHz；同样地，使用80MHz调制频率时，调谐系列包含80,160,240，……，80n MHz。
荧光信号的采集包含这些调谐信号；总体来说，大约有30调谐能够被探测到。最大调谐信号的探测依赖于测量过程中光电探测器的上升时间。选择调制频率的依据，最终是取决于测量衰减寿命的范围。
DFD仪器采样示意图如Figure 4所示。DFD模块提供光源（LD，LED）的调制信号。如果光源是脉冲光源（脉冲激光器，超连续激光器，多光子激光器），DFD模块将配置脉冲光源的CLK。
Figure 3 LD和LED调制单元示意图。DFD模块为光源提供调制信号。
四、频域法数据分析
每当我们要进行n个采样数值
分析时，我们期望设置一个函数
用来描述数据，一般方法是最小化
函数，定义为：
其中，
观察
时的标准偏差，假设
的误差忽略不计。
高斯变量的总数称为（chi-square，卡方值），具有n个自由度。这个函数定义在
，由参数n定义；它的函数特征是平均值等于n，方差等于2n。
的分布是一个非常强大而且有用的工具（卡方值测试），可以用来评估测量值的拟合度和理论值的好坏。拟合程度的好坏表示多大程度上测量值符合统计模型。测量拟合程度的好坏能够概况描述测量值和理论模型期望数值之间的差异。一旦自由度n确定后，数值被计算出来，可以直接在很多数学工具书上查收分布的百分率。例如，假设n=5，计算德大
；通过查表发现
；意味着如果多次重复测量，有80%的几率小于7.2，虽然存在20%的几率数值将高于7.2.
时下，在每一个拟合问题上，通常的实际操作是使用简化的
标准的形式为
n表示测量实验点，p代表测试中决定的参数个数。
当多次测量相移
和调制
的数值，在相位调制图上的每一点都是关于频率的函数，拟合的理论曲线和测量数据点可以通过最小化函数。这里（h，k）指代相位调制图上的特定点。
Figure 4 BodipyFL（氟硼二吡咯）水溶液的频率响应 (相位和调制系数曲线)，使用ChronosDFD在 471nm激光二极管。发射线收集使用的是 520KV高通滤波器。数据的最佳拟合呈现指数衰减方式，衰减时间5.87 ns (x2 = 0.97).
五、拟合数值的判断
在荧光寿命测量过程中，有三个参数能够帮助我们判断拟合是否准确。
-
简化的
数值
理论上能够证明在足够多的实验数据点
,
函数的极限是唯一的，即
当数值
时，说明测量不准确，测量选择了错误的分布函数和不准确的误差评估。当
时，测量也不准确，可能源于错误的实验测量。
B)残差
残差
定义如下
表示最优的拟合测量数据点计算的函数。在多数情况下，通常利用权重残差
，定义如下
其中是第i个数据点的标准偏差。对于好的拟合结果，残差荧光近似围绕着零分布。
Figure 5 一般残差（residuals）分布图。（ISS ChronosDFD 测量获得 ）
C)协方差矩阵
一个变量的方差表示测量变量数字相对平均值的离散分布情况。这个概念怎么才能普遍的推广到具有同时性的n个变量，而不是简单的只表征一个变量？如何能够通过数字表达n维联合概率密度分布？
其实在实际中没有一个普遍的方法解决这些问题，除了数据的分布是多维正态分布。然后，这个分布可以完全被表征为：
-
定义平均矢量μ，
-
设置两两成对的协方差
，包含变量
（也表示为
）
每当大量数据具有随机变量，每一个变量都具有有限方差时，数据可以被矢量代表
,其后协方差矩阵H表示
系数，定义为
其中
表示第i个数值在矢量x的期望值。
相关性矢量是协方差矩阵的变量归一化，每一个元素可以表示为
对角斜线都是“1”；非对角线位置（i, j）是相应的r
，变量
相关性系数。矩阵是对称的。
