荧光技术介绍

荧光技术介绍

 

科研工作者必须对所使用的荧光仪器和实验细节有所了解，才能成功地运用荧光分析法。这是因为：①荧光法是一种高灵敏度的分析方法，人们总是以提高仪器的增益或放大倍数来获取可观测到的信号，但这种信号可能不是产生自我们所希望检测的荧光体，而是可能来自洛剂的背景荧光干扰、仪器的漏光、混浊溶液的散射光、瑞利散射和拉曼散射；②荧光法所使用的荧光光谱仪和仪器不是理想的仪器，不可能产生真实的激发光谱和发射光谱，因为这些仪器的光源输出不一致、单色器和光电倍增管（PMT）的效率与波长有关、荧光偏振或各向异性亦可能影响到荧光强度的测定。因此，要获取可靠的光谱数据，人们就必须了解和控制这些因素。本章将就荧光光谱仪各个组件的特性，影响有关参数测量的样品性质。

在荧光分析中常用的仪器主要为荧光计和荧光光谱仪两类，它们均由光源、单色器（滤光片或光栅）、狭缝、样品室、信号检测放大系统和信号读出、记录系统组成。光源用来激发样品，单色器用来分离出所需要的单色光，信号检测放大系统用来把荧光信号转化为电信号，联结于放大装置上的读出装置用来显示或纪录荧光信号。一般荧光光谱仪如图1所示。当激发单色器改为滤光片时则为一般的荧光计。当进行荧光偏振实验时，则在样品室的人射光路和发射光路两侧分别装上起偏器和检偏器。

 

图1荧光光谱仪示意图

其他荧光仪器有激发时间分辨荧光光谱仪、相分辨荧光光谱仪和及最近发展起来的各类便携式现场荧光计等。

1.荧光仪器组件

1.1激发光源

理想化的光源：由于荧光体的荧光强度与激发光的强度成正比，因此，作为一种理想的激发光摞应具备：①足够的强度；②在所需光谱范围内有连续的光谱；③其强度与波长无关，亦即光源的输出应是连续平滑等强度的辐射（见图2)；④光强要稳定。符合这些要求的光惊实际上并不存在，这给荧光体真实激发光谱的测绘带来很大困难。

 

图2.理想光源的光强度与波长关系

1.氙灯

高压氙弧灯是目前荧光光谱仪中应用最广泛的一种光源。这种光源是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充缸气，室温时其压力为5atm（非法定单位，latm = l.01325×105Pa），工作时压力约为20atm。250-800nm光谱区呈连续光谱，450nn附近有几条锐线（见图3）。其工作时，在相距约8mm的钨电极间形成一强的电子流（电弧），氙原子与电子流相撞而离解为侃正离子，氙正离子与电子复合而发光。在武原子的离解发射连续光谱，而激发态的缸则发射分布于450nm附近的线状光谱。侃弧灯的光谱输出，短于280nm区的强度迅速下降。有的氙弧灯为无臭氧灯，即工作时氙灯周围不产生臭氧，这种灯所用的石英外套不透射波长短于250nm的光，但这种灯的输出信号强度随波长缩短而迅速下降。新近推出的闪烁式氙灯结合经优化的光学系统可使荧光光谱仪达到非常优异的灵敏度。由于使用闪烁式氙灯的荧光光谱仪只有在其发光时读取数据，特别适用于对光敏感的样品的测定。另一方面，闪烁式氙灯结合相应的信号处理技术，可使相应的荧光光谱仪在样品暴露于日光的情况下测定荧光数据。

 

图3.短弧高压氙灯的光谱能量分布

2.激光器

紫外激光器、固体激光器、可调谐染料激光器和二极管激光器的运用把荧光法推向一个新的高度，激光技术的运用，使荧光法成为世界上第一个实现单分子检测的技术手段，并使其成为目前高性能荧光仪器的主要光源。发射波长377nm的紫外激光器．其强度比汞灯的366nm线（三重线〉强得多，且单色性好，没有杂散光。可调谐激光器可用紫外激光器为激发光源，产生波长范围为360-650nm的激光。

可调谐染料激光器是一种用有机荧光料作为工作溶液，用其他光源、或激光作为激励的激光器。工作时荧光染料分子被外光源激发而发荧光，当满足一定的物理条件之后，这种荧光就转化为激光。荧光染料盛于染料池中，用外光源激发，用调谐元件（光栅等）调节所需要的波长光，用光学标准具进一步压缩谱线宽度，如果需要紫外线输出，则把非线性晶体置人激光腔内，经调谐的一部分激光由反射镜输出，余下大部分被反射，以供进一步光学放大，通过把光栏置人激光腔内，以便实现单模运转。

一般荧光染料的有效发射波长范围约为20-50nm，如果要在较大范围内获得可调谐的激光，就得使多种染料溶液分别连结流过染料池。采用可调谐激光为光源时，可略去荧光光谱仪的单色器或滤光片。

在过去的几十年中，激光技术得到了迅速的发展各类激光光源层出不穷，如准分子激光器、二极管抽运激光器、高亮度二极管激光器、红光蓝光二极管激光器、二氧化碳激光系统、固体激光系统、染料、离子激光器，从而使各类荧光仪器的种类和型号更加完善。

l.2单色器

1.光栅单色器

荧光光谱仪中应用最多的单色器是光栅单色器而不是棱镜单色器，理想的单色器应在整个波长区内有相同的光子通过效率．不幸的是这种理想的单色器并不存在，它亦是荧光体激发光谱和发射光谱变形的原因之一。

光栅有平面光栅和凹面光栅两类。平面光栅多采用机械刻制，一般每毫米刻有600-1200条的三角钱槽，其闪耀、波长视用途而定。机刻光栅的主要缺点是线槽不完善，杂散光较大，可能存在“鬼影”。凹面光栅常采用全息照相和光腐蚀而成，不完善辑度小得多，它适于测绘激发和发射光谱．而不大适于荧光各向异性的测量。

光栅单色器有两个主要性能指标，即色散能力和杂散光水平，色散能力通常以nm/mm表示，其中mm为单色器的狭缝宽度。通常人们总是选用低杂散光的正在色器来组装荧光光谱仪，以减少杂散光的干扰，同时选用高效率的单色器来提高检测弱信号的能力。对于一般荧光光谱仪来说，单色仪的分辨率不是主要问题，因为荧光计的荧光峰宽度很少小于5nm。单色器一般都有进、出光两个狭缝，出射光的强度约与单色器狭缝宽度的平方成正比，增大狭缝宽度有利于提高信号强度，缩小狭缝宽度有利于提高光谱分辨力，但却牺牲了信号强度。对于光敏性的荧光体测量，有必要适当减少入射光的强度。

 

图4.平面光栅单色器

图4为泽尼特式光栅单色器的示意图，图4(b）为衍射光栅的截面图。入射光照射于平面光栅的三角钱槽上则发生反射，各反射光束间的干涉则引起色散。色散特性可由光栅方程描述。光栅方程为

Νλ=d(sini十sinθ)              (1)

式中：N为干涉（衍射）的级数。光栅方程说明了对于某一给定的衍射角，同时可能有几个不同级的谱线存在，当荧光体信号很微弱时测绘激发光谱和发射光谱尤应注意，因为此时仪器的放大（增益〉处于较高档，二级光很容易被检出。例如320nm光激发40ppb的奎宁（0.lmol/LH2SO4）所测绘得的发射光谱，可能出现5个峰，它们分别出现320,360,450,640和720nm波长处，这些峰分别为水的瑞利散射、水的拉曼散射、奎宁的荧光峰、水的二级瑞利散射和水的二级拉曼散射；又如当发射单色器的披长固定在690nm波长处而扫描水中绿球藻的激发光谱时，会在345nm处出现一个尖锐的激发峰，这个峰实质上是水的二级瑞利散射所造成的，分析者需予以注意。

光栅单色器的透射率为波长的函数，机刻光栅的输出最强光的波长被称为闪耀披长。光栅的闪耀波长由光栅的闪耀角而定，而闪耀角则由光栅的线槽角而定。为了弥补激发光源（氙灯）紫外区能量弱的缺点，荧光光谱仪多选用闪耀波长落于紫外区（例如300nm）的单色器为激发单色器。由于荧光体的荧光波长多落于400-600nm区，因而发射单色器常采用闪耀被长为500nm左右的光栅。全息光栅没有闪耀波长，其透射峰值比平面光栅小，但波长分布比平面光栅大得多，图5为几种不同闪耀波长光栅的能量分布。

 

图5.几种不同闪耀波长光栅的光谱能量分布

光栅单色器的另一重要特性在于它的透射率与偏振光有关，图6为平面光栅和全息四面光栅的透射率与偏振光的关系。可见，所检测到的荧光强度与荧光的偏振有关，所检测到的发射光谐的波长可能漂移，形状可能改变，这些与记录时所用的偏振条件有关，例如用图6所示的机刻光栅和全息光栅记录发射光谱时，偏振器垂直取向者，总比水平取向者所记录得到的光谱要略向短波长。方向移动，因为该单色器在短波长区的垂直偏振光有较高的透射率。这种光谱的漂移与样品无关，亦与样品是否发生偏振无关。

 

图6.全息光栅和机刻光栅的透射效率

 

图7.偏振器取向对N-乙基-L-色氨酰胺（NATA）发射光谱的影响

pH=7.5,25℃；λex=280nm；

我们以图7所示的N-乙基-L-色氨酰胺（NATA）的发射光谱来进一步说明这个问题。用垂直取向偏振器（V)和水平取向偏振器（H）的光所记录得到的发射光谱有明显的差别。正如意料中那样，通过垂直取向偏振器所观测到的光谱比通过水平取向偏振器者相对地蓝移。光谱中390nm处的额外峰系单色器的透射特性所引起的。有一种方法可以避免光栅单色器因偏振光透射率变化而带来的影响，这种办法系采用所谓“魔鬼角”的原理。实验时用垂直偏振光激发，使检偏器的取向与垂直偏振光成54.7°角，设总荧光强度为（IT），(IT)= I∥ + 2I⊥，而I∥和I⊥分别代表垂直和水平偏振发射的荧光强度，则在此条件下所测得的信号强度正比于总荧光强度（IT）。必须提到的是，采用偏振时，荧光信号光强度将小于原有的1/4左右。

由于散射光是100%全偏振光，采用发射偏振器与激发偏振器垂直取向可大大减少散射光对荧光测量的影响（见图7）。

对于荧光测量来说，单色器的杂散光指标是一个极关键的参数。杂散光被定义为除去所需要波长的光线以外，通过单色器的所有其他光线的强度。首先考虑激发单色器，通常紫外线被用来激发荧光体，而氙灯中的紫外线强度仅约为可见光的1%。荧光体的荧光一般都很弱，通过激发单色器的长波长的杂散光，容易被当作荧光来检测。许多生物样品都有较大的浊度，结果入射的杂散光被样品散射而干扰荧光强度的测量。由于这个原因，某些荧光光谱仪采用双光栅单色器，这样来，虽然杂散光可降至峰强度的10-8-10-12，可是其灵敏度也将降低。

现在让我们考虑发射单色器。通常入射的激发光仅有非常小的一部分被荧光体吸收（小于4%），而荧光体的荧光产率很低，其荧光强度般小于激发光强度的千分之一。假设我们测量的是一个浊度较高的生物样品，例如测量键合蛋白质的荧光强度，该样品用280nm光激发，于340nm处测量荧光强度。由于发射单色器不完善，某些280nm的散射光可能于340nm处通过发射单色器而照射于检测器。假设340nm对280nm的分辨率为10-4，280nm波长处的散射光强度可能比340nm波长处的荧光强一千多倍。因此，测得10%的“荧光”实际上是因散射所引起的杂散光所造成的。由于散射光100%偏振，因此，散射光所引起的杂散光可能使荧光各向异性的测量失效，这一点要特别留意。

凹面光栅多为全息光栅，其单色器较完善，很少出现“鬼影”，大面积光栅不需聚焦，反射面少。

1.3检测器

l.光电倍增管

目前，几乎所有普通荧光光谱仪都采用光电倍增管（PMT）作为检测器。PMT是一种很好的电流源，在一定的条件下，其电流量与人射光强度成正比。虽然PMT对各个光子均起响应，然而平时都是测量众多光子脉冲响应的平均值。

PMT由一个光阴极和多级的二次发射电极所组成。光照射于光阴极时会引起一次电子发射，这些光电子在PMT中被电场加速飞射到第一个二次发射极〈打拿极〉上时，每个光电子将引起5~20个二次电子发射，这些电子又被加速到下个电极上去，如此多次重复，最后电子被集中到阳极上去。所产生的电流被放大到可检测的水平。PMT的光电子产生率与施加于光阴极的高压值有关，一般PMT常用-500~-l000V的电压。有些型号的PMT则用-1000～-2000V。电压越高，每个二次电极发射的电子越多，因而PMT本身的放大作用就越大。

PMT的灵敏度受暗电流的限制，而暗电流主要由阴极和二次发射极的热电子发射和电极间的漏电流所形成。电极间电压低时，暗电流主要来自漏电流；电极电压高时，则主要来自热电子发射。

PMT有侧窗式和端窗式两类，图8为端窗式PMT和它的二次电极串示意图。

 

图8. 端窗式PMT和它的二次发射电极串示意图

线性响应：要进行定量测定，PMT的阳极电流一定要正比于光强度。但在强光照射下，光阴极电流会超过PMT的容许值，此时光阴极与第一打拿极间的电位差下降，引起增益下降和非线性响应。此外，过量的光电流可能损害光阴极的光敏性，造成暗电流增加，放大性能变差。要获得良好的线性响应，就要求PMT的高压电源很稳定，要求它与入射光量和阳极电流无关，因此把打拿极串设计成其电流量最小值应为阳极容许最大电流的100倍，例如一个由6级打拿极组成的PMT，其电阻串每级为l00kΩ.，电压为l000V，则电阻串的电流为l.6mA，因此其阳极容许最大电流量为l6μA。

PMT的电压电源：典型的PMT电压每增加l00V，增益就提高3倍，因此，电压每波动IV，增益就随之波动3%，可见PMT的高压电源稳定度应为0.01~0.03V。

 

图9.几种PMT的光谱响应特性

PMT的光谱特性：不同型号的PMT，由于所采用的光阴极光敏材料不同，其光谱响应特性亦不同（见图9），常见的光敏材料有碱金属及其氧化物、银和氧化银、铯和氧化以及金属锑等。石英泡壳的PMT适用于紫外线区。1P28，s-5或9635QB型的PMT，具有较高的灵敏度和较小的暗电流，但它适用于波长200~620nm区，波长大于650nm时其光谱响应率几乎为零。有些型号的PMT，其光谱响应范围可扩展至近红外线区，但暗电流一般较大。由于单色器和PMT的非理想化光谱响应，因此，发射光谱就受到歪曲。要获得真实的发射光谱就必需进行校正。

PMT的响应时间：PMT的响应时间很短，能检测出10-8和10-9s的脉冲光。PMT的响应时间与两个因素有关，即与PMT的光电子运行时间和光阴极的颜色效应有关。对于稳态测量来说，不同PMT的响应时间差并不重要，而对荧光体寿命的测定来说，这种时间差却要认真对待。光子自到达PMT的光阴极起至PMT阳极脉冲电流出现之间的时间为PMT的运行响应时间，典型的PMT的运行时间约为20ns，它既与光电子自光阴极至阳极所取的集合路线有关，亦与光电子所产生的光阴极部位有关，即使产生于同一光阴极部位的光电子，亦可能由于运行路线不同而有时间差，因此而取其运行时间的平均值。改善光阴极和阳极的集合排列有利于减少光电子的运行轨迹差，因而可减少光电子的运行时间分散。减少光阴极的受光面积和用电磁场的办法使电子直线飞行亦有利于减少光电子运行时间的分散。

PMT的光色效应：不同波长的光子，其能量不同，当它们照射于PMT时，其响应时间亦有差别，这种现象称为光色效应（color effect）。光色效应对荧光寿命的测量可能带来显著误差，应予注意。

PMT失效的预兆：①当PMT接上高压电源时可观测到脉冲电流，电压降低时可能出现信号不稳定，例如在2~20s内其增益可能变动20%乃至儿倍。这种现象通常是由于管子漏气引起的。这种管子无法修复，必须更换。在某些情况下，该管子还可在低电压下进行操作；②反常高的暗电流，即无光照时PMT有反常大的信号出现，其原因通常是管子过度曝光，尤其是当PMT接上高压电源后的曝光特别危险。这种管子除了更换或用较低的电压外没有别的补救办法。有时信号不稳定并不是PMT失效，而是其他原因引起的，例如仪器是否漏光，高压电源和放大器运行是否正常，PMT的插头与管座是否连接好，样品是否具有光敏性等。此外，应小心使用PMT，它们的外壳、不要蒙上灰尘或印上指印，外壳不要用裸露的手触摸。光阴极具有光敏性，最好所有操作都在弱光下进行。

2.电荷相合器件阵列检测器

电荷耦合器件阵列检测器（charge-coupled device，CCD）是一类新型的光学多通道监测器，它具有光谱范围宽、量子效率高、暗电流小、噪声低、灵敏度高、线性范围宽，向时可获取彩色、三维图像等特点。CCD是一种灵敏的固体成像装置，一般来说CCD的有效成像面积为1~8cm2.现在商品型号的CCD有576×384像素、5126×512像索、1024×1024像素、400万像索、800万像素等系列产品。

CCD的工作原理：当光学系统把景物成像于CCD像素表面时，由于光激发照射到CCD后其内部半导体内就会产生电子，并由此产生电荷，从而产生电子-空穴对，其中少数的载流子被附近的势阱所收集。由于其存储的载流子的数目与光强有关，因此一个光学图像就可以被转化成电荷图像，然后使电荷按一定的顺序转移，最后在输出端输出，从而使光学信号转变成视频信号。

CCD有两种形式。一种是线阵CCD，一种是面阵CCD。线阵CCD是由许多像素排列成一行并以一定的形式联接起来的一个器件。而面阵CCD是由许多像素排列成一方阵并以一定的形式联接起来的一个器件。因此，线阵CCD就如同一个单坐标系，获取的信息少，不能处理复杂的图像。但其处理信息的速度快，后续电路简单。而面阵CCD就如同一个双坐标系，获取的信息大，能处理复杂的图像。但其缺点是处理信息速度慢，而且价格昂贵。

分析物CCD的荧光光谱：多通道的CCD检测器，其多色仪没有出射狭缝，分析物的荧光从入射狭缝进入多色仪，经光栅分光后，以一连续谱带照射到CCD光敏区，取阵列像素累加后的光致电荷输入计算机处理，即可得到分析物的荧光光谱。因此，CCD检测器具有连续对荧光光谱多次采集，得到强度-波长-时间三维图谱的功能。不仅可以将其用于荧光反应动力学的测定，而且特别适合低光水平的成像，这一点对于克服生物样品的光漂白现象是非常重要的。